изучение эффектов перфторана

Е.А. Туховская 1, А.Н. Мурашев 1, Е.И. Маевский 2, Г.Р. Иваницкий 2, И.А. Масленников 3, С.Ю. Пушкин 3, А.А. Орлов 2

1.Лаборатория биологических испытаний ФИБХ РАН, Пущино, 2Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино,
3ОАО НПФ «Перфторан», Пущино

Введение.
Целью проведения данной научно-исследовательской работы было изучить эффекты Перфторана и его компонентов на гемодинамику и гемостаз у спонтанно гипертензивных крыс склонных к инсульту SHR-SP. Эти животные имеют ряд аномалий сосудистой системы – таких как структурные нарушения сосудистой стенки, выраженные в уменьшении просвета сосудов [4, 5, 7], патологии функциональной активности эндотелия сосудистой стенки, сказывающиеся в нарушении микроциркуляции и реологии [6]. Среднее артериальное давление (САД) у SHR-SP в два раза выше, чем у нормотензивных животных (WKY). Высокий уровень САД строго коррелирует с церебральной дисфункцией [6]. Перечисленные свойства SHR-SP позволили использовать их в качестве модельной системы для изучения влияния Перфторана и его компонентов на уровень артериального давления (АД) и гемостаз на фоне гипертензии и структурно-функциональных нарушений сосудистой стенки.

Материалы и методы.
Самцы SHR-SP были разделены на 4 группы. Первой (П1) вводился Перфторан, второй (П2) – Проксанол, третьей (П3) – солевой раствор, и четвертая (П4) – интактные животные. Растворы всех веществ были взяты в тех же концентрациях, в которых они входят в состав эмульсии Перфторан.

Животным под наркозом (20% хлоралгидрат 200 мкл/100г внутрибрюшинно) вживляли полиэтиленовые катетеры в сонную артерию для регистрации АД и в яремную вену для введения препаратов. На следующий день после операции животных брали в опыт. Опыт проводили параллельно с 4-мя животными (по одному животному из каждой группы).

В течение 5 минут регистрировали базовый уровень АД. Затем, в течение 3 минут, инфузионно вводили соответствующие групповой принадлежности вещества в объеме 10% от объема циркулирующей крови (ОЦК) (кроме интактных животных). Продолжали регистрацию АД в течение 60 минут, затем производили забор 2 мл крови для анализа гемостаза. Кровь собирали в пробирку, содержащую 180 мкл 3,8% раствора цитрата натрия, центрифугировали для получения плазмы при 1000 оборотов в течение 7 минут. Богатую тромбоцитами плазму переносили в чистую пробирку и повторно центрифугировали при 3000 оборотов в течение 15 минут.

Изучали следующие показатели гемостаза:

— Активированное парциальное тромбопластиновое время (АПТВ-тест)

— Протромбиновое время, определение концентрации фибриногена (Квик-Фг-тест)

— Фибринолиз-тест

— Определение антикоагулянта волчаночного типа (АВТ) (Люпус-тест)

— Тромбин-гепариновое время свертывания – определение чувствительности тромбинового времени плазмы к гепарину (Гепарин-тест)

Затем производили забор 5 мл крови для моделирования гиповолемического шока. При этом регистрировали АД и ЧСС в течение 37 минут.

Статистическую обработку оцифрованных показателей гемодинамики и показателей гемостаза осуществляли с помощью программы Exсel, программы Statistica for Windows 5,0. Статистически достоверные изменения параметров по сравнению с исходными значениями в каждой группе оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA-1) по ранговому тесту Дункана. Для статистической оценки межгрупповых различий использовали двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA-2) также с применением рангового теста Дункана. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.

Результаты и обсуждение.
Регистрация АД и ЧСС у животных экспериментальных групп после введения Перфторана и его компонентов и интактных не выявила достоверно значимых изменений по сравнению с исходным уровнем. Также не наблюдалось отличий между четырьмя группами животных (на Рис. 1. с 1-й по 61-ю минуту). Забор двух миллилитров крови на анализ показателей гемостаза, не вызывал значительных изменений АД и ЧСС ни в одной из групп, так как объем забираемой крови не превышал 10% от ОЦК (на Рис.1. с 61-й по 79-ю минуту).

Рис.1. Динамика изменения АД при внутривенном введении Пефторана и его компонентов и у интактных животных (обозначения маркеров — на графике).

1 – внутривенное введение веществ в объеме 10 % от ОЦК
2 – забор 5 мл крови для моделирования гиповолемического шока
* — достоверно значимые различия между группами П1 и П4 (р < 0,05) по ANOVA 2
# — достоверно значимые изменения (р < 0,05) по отношению к исходному уровню по ANOVA 1

У животных всех четырех групп развивалась мгновенная гипотензия в ответ на забор 5 мл крови для моделирования гиповолемического шока (на Рис. 1. с 80 по 116 минуту). Первоначальное падение АД при развитии гипотензии имело достоверные различия между группами П1 (Перфторан) и П4 (интактные). На 2-й минуте после забора крови (на 81-й на Рис.1.) АД упало у интактных животных на 51,1 ±17%, в то время как у животных группы П1 АД упало на 33,3±10%. Это подтверждает протекторный эффект Перфторана, оказываемый на гемодинамику [2].

Скорость восстановления АД различалась во всех четырех группах (Рис.2.). Наиболее высокая скорость нарастания АД наблюдалась в группе П1 и составляла в среднем 0,733% в минуту против 0,280%/мин у интактных, 0,044%/мин у животных, получавших солевой раствор и 0,618 %/мин у животных, получавших Проксанол.

Рис.2. Динамика нарастания скорости АД при гиповолемическом шоке у крыс SHR-SР при введении 10% от ОЦК Перфторана, Проксанола и солевого раствора и интактных животных, выраженная в процентах

Цифры напротив маркеров обозначают нарастание АД в %/мин
¯- стрелка обозначает момент падения АД при создании экспериментальной модели гиповолемического шока

В плазме определяли показатели гемостаза.

Оценка активированного парциального тромбопластинового времени не показала достоверно значимых различий в четырех группах.

Достоверных отличий между группами не наблюдалось также при оценке протромбинового времени (Квик-тест) и тромбин-гепаринового времени (Гепарин-тест). Это говорит о том, что Перфторан и его компоненты, введенные внутривенно в объеме 10% от ОЦК, не влияют на коагуляционные свойства плазмы. Также не меняют они чувствительности тромбинового времени к гепарину, то есть антикоагулянтные свойства плазмы также остаются незатронутыми.

При оценке плазмы на наличие АВТ (Люпус-тест), отсутствие снижения времени свертывания в скрининговых тестах (тромбопластиновое время с разведенным тромбопластином и лебетоксовое время свертывания ) дало основание говорить об отсутствии в плазме АВТ.

Концентрация фибриногена (Квик-тест) не отличалась от группы П4 (интактные) у остальных трех групп. Но наблюдалась тенденция к увеличению концентрации свободного фибриногена в плазме животных группы П2 (Проксанол) по отношению к группе П1 (Перфторан). Вероятно, это является следствием активации фибриногена поверхностно-активным веществом Проксанолом. Известна способность проксанолов активировать плазменную систему комплемента [3]. Также описано достоверное понижение свертываемости крови в экспериментах in vitro при смешивании плазмы с высокими концентрациями проксанолов [1].

Время активированного стрептокиназой лизиса сгустка не отличалось в четырех группах, что позволяет судить об отсутствии влияния Перфторана и компонентов на фибринолитическую активность плазмы.

Таким образом, проведенное исследование позволяет говорить об отсутствии влияния как Перфторана так и его компонентов на систему гемостаза у крыс SHR-SP при введении им внутривенно этих растворов в дозе 10% от ОЦК.

Влияние на гемодинамику Перфторана и его компонентов при таком способе и дозе введения не было показано в нормоволемическом состоянии. Но при моделировании гиповолемического шока (забор 5 мл крови из артерии) выявлено достоверное различие в АД на первой минуте после его падения между группами П4 и П1. Так же восстановление АД после гиповолемического шока протекает с наибольшей скоростью под влиянием Перфторана по сравнению с его компонентами и интактными животными. Это позволяет говорить о протекторном действии Перфторана на гемодинамику при гиповолемии.

Литература.
Панченко С.М., Путятина Т.К., Мясникова О.В., Рыболовлев Ю.Р., Кличева Т.Д., Афонин Н.И. Влияние эмульсий фторуглеродов на систему свертывания крови. — Медико-биологические аспекты применения эмульсий ПФУ, Пущино. — 1983. — с.85-90

Перфторан кровезаменитель с газотранспортной функцией. Инструкция для врачей клиник СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова. – СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова. – 2001. – 24 С.

Dale E. Hammerschmidt, Gregory M. Vercelotti. Limitation of Complement Activation by Perfluorocarbon Emultions: superiority Lecitin — Emulsified Preparations. — Biomat. Art. Cells, Art. Org. — 1998. — v.16(1-3). – p.431-438

Gray, S.D. Pressure profiles in neonatal spontaneously hypertensive rats. Biological Neonate. – v.45 – p.25-32.

Morton JJ, Beattie EC, Griffin SA, MacPherson F, Lyall F, Russo D . Vascular hypertrophy, renin and blood pressure in the young spontaneously hypertensive rat. — Clinical Science. – 1990 – v.79. — p.523–530

Okamoto K, Yamori Y, Nagaoka A. Establishment of the stroke-prone spontaneously hypertensive rat (SHR). — Circ Res. – 1974. – v.34&35. — p.143 –153

Silvia M. Arribas, John F. Gordon, Craig J. Daly, MSc; Anna F. Dominiczak, MD; John C. McGrath. Confocal Microscopic Characterization of a Lesion in a Cerebral Vessel of the Stroke-Prone Spontaneously Hypertensive Rat. — Stroke. 1996. – v.27. – p.1118-1123